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逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription），是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程，合成的DNA稱(chēng)為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程遺傳信息的流動(dòng)方向?yàn)?/span>RNA到DNA，與轉(zhuǎn)錄過(guò)程DNA到RNA的方向相反，故稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄。
一、實(shí)驗(yàn)原理要素：
酶促催化使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交，然后由RNA依賴(lài)的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA拷貝，后者能進(jìn)一步用于PCR擴(kuò)增。依據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的，針對(duì)cDNA第一鏈合成的引物可根據(jù)特殊的靶基因設(shè)計(jì)，或可用隨機(jī)引物與所有mRNA雜交。
實(shí)驗(yàn)要素：
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：
逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對(duì)，可合成全長(zhǎng)的 cDNA，但僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA ，對(duì)模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基，可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續(xù) qPCR 實(shí)驗(yàn)。基因特異性引物可以識(shí)別特定模板序列，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。
2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：
一種是來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對(duì)較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對(duì)獲得2-3kb的 mRNA 的全長(zhǎng) cDNA 有很大好處。
3. RNA 模板：
通常利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無(wú) gDNA 和蛋白殘留。
二、實(shí)驗(yàn)流程：
1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
RNA樣品、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（以諾唯贊R312為例）
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
① 試劑化凍后，用手輕彈混勻后短暫離心。
② 基因組DNA（gDNA）去除：根據(jù)RNA樣品的濃度按10pg~1μg計(jì)算用量，在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA樣品，總體系為10μL。用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件為42℃ 2min。
③ 第一鏈cDNA合成：根據(jù)上一步反應(yīng)管的數(shù)量按以下體系在RNase-free離心管中配制預(yù)混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆轉(zhuǎn)錄引物（2μM）1μL，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混勻后短暫離心。在上一步得到的反應(yīng)管中每管加入10μL，用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件為25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min。所得cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)或-20℃保存。
三、注意事項(xiàng)：
1. 防止RNase污染：保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗(yàn)所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。
2. 反應(yīng)液的配制要在冰上操作完成，防止溫度過(guò)高造成RNA降解。
3. cDNA保存時(shí)避免反復(fù)凍融。
四、常見(jiàn)問(wèn)題：
1. 逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物可以測(cè)濃度嗎？
不建議測(cè)濃度，一般評(píng)估RNA模板的質(zhì)量，需要從濃度、純度及完整性三方面進(jìn)行考量，但逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是一個(gè)混合體系，有cDNA、未全逆轉(zhuǎn)錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分，會(huì)干擾cDNA的吸光度，因此不建議用逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA來(lái)檢測(cè)濃度與純度。
2. 如何檢測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成功與否？
1) 內(nèi)參法：理論上，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA是長(zhǎng)度不同的DNA片段，所以電泳條帶應(yīng)該均勻分布在泳道上，如果RNA豐度低，電泳檢測(cè)也可能無(wú)產(chǎn)物，這種情況通過(guò)PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因，如果有擴(kuò)增產(chǎn)物，cDNA的質(zhì)量基本上可以保證(少數(shù)情況下：如目的基因片段過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)有例外)。
2) 已知基因擴(kuò)增法：如果有已知以此模板擴(kuò)出來(lái)的基因，可以用此基因的引物驗(yàn)證。能擴(kuò)增出內(nèi)參，不一定就說(shuō)明cDNA沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)閮?nèi)參在cDNA中豐度高，容易擴(kuò)增。如果cDNA因?yàn)楦鞣N原因?qū)е虏糠纸到猓瑒t會(huì)大大影響低豐度的目的基因的PCR結(jié)果，而內(nèi)參因?yàn)槭歉哓S度基因，擴(kuò)增很可能不受影響。
3. 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在gDNA對(duì)后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)有何影響？
當(dāng)cDNA產(chǎn)物中混有gDNA時(shí)，cDNA和gDNA在qPCR反應(yīng)時(shí)會(huì)被同時(shí)擴(kuò)增，無(wú)法區(qū)分熒光信號(hào)是來(lái)自于cDNA還是gDNA，因此定量結(jié)果可能會(huì)存在偏差。特別是低表達(dá)量的基因，本身的擴(kuò)增信號(hào)低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影響。在逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，加一步gDNA去除的步驟，能夠有效降低gDNA污染的影響，增加實(shí)驗(yàn)的可信度。
